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식물체내에서 발현될 수 있도록 Ti-plasmid 나 Ri-plasmid를 개량하는 것 셋째, 식물체에 감염되는 적절한 Agrobacterium strain의 선정과 둘째, 이러한 과정을 transformation이라 하며 다음과 같은 단계를 거쳐 이루어진다.coli cell membrane에 존재하는 lipid의 negatively ch-arged phosphate와 complex를 이룰 것으로 추정된다. (나) Agrobacterium 이용 방법 Agrobacterium은 토양중에 있는 Gram(-) 박테리아로써 식물의 상처부위에 침입하여 Corwn gall이라는 종양이나 Hairy rout를 형성하며 식물에 대해 광범위한 기주범위를 가지고 있다. 전기충격에 의한 유전자도입은 원래 Electric field mediated transformation이 정확한 용어이나 Electroporation이라고 쓰이고 있으며 비슷한 용어로 Electroinfection 그리고 Electrotransfection이라는 용어도 있다. 식물에 유전자를 도입하는데 이용하기 위해서는 박테리아 자체와 기주식물체 양쪽의  ......

Index & Contents

유전공학 - Transformation의 원리와 종류

유전공학 - Transformation의 원리와 종류

Transformation의 원리

E.coli는 linear 또는 circular DNA를 받아들일 수 있는데, 이러한 과정을 transformation이라 하며 다음과 같은 단계를 거쳐 이루어진다. E.coli cell이 DNA를 uptake 할 수 있는 상태(competent)로 만들어 주기위해 E.coli cell을 Ca과 같은 multivalent ion의 존재 하에 0℃에서 incubation한다. 이때, cation은 E.coli cell membrane에 존재하는 lipid의 negatively ch-arged phosphate와 complex를 이룰 것으로 추정된다. 낮은 온도는 cell membrane을 응고시켜 ch-arged phosphate의 분포를 안정화하여 cation에 의하여 효과적으로 shield되게 하여준다. 이때 37℃~42℃로 heat shock을 가하면 E.coli membrane내외의 thermal imbalance가 생겨 DNA가 세포 안으로 빨려 들어가게 된다. 이외에 electroporation에 의한 transformation으로 electric ch-arge를 E.coli cell에 순간적으로 가하여 이때 생긴 pore를 통해 DNA를 세포 안으로 넣는 방법이 있다. Host cell로 들어간 DNA는 ampicillin내성 유전자(Beta lactamase를 cording하는 유전자)가 포함된 plasmid를 사용하여 ampicillin이 포함된 배지에서 선별해서 확인한다.

Transformation의 종류

가) 전기 충격법(Electroporation)

이 방법은 전기충격을 극히 짧은 시간동안 원형질체에 가하여 세포에 구멍을 뚫어 외래 DNA를 세포내로 넣는 것인데 장치(Electroporator)의 종류에 따라 약간의 차이는 있으나 원리는 같으며 샘플의 종류 및 장치의 종류에 따라 경험적으로 전압 및 시간들을 조절 사용하면 된다. 전기충격에 의한 유전자도입은 원래 Electric field mediated transformation이 정확한 용어이나 Electroporation이라고 쓰이고 있으며 비슷한 용어로 Electroinfection 그리고 Electrotransfection이라는 용어도 있다.

이 방법은 식물뿐만 아니라 박테리아, 효모, 진균 그리고 동물세포에까지 널리 적용되고 있다. 그러나 세포종류가 달라짐에 따라 다른 전기적 조건을 설정해야 하며 식물에서는 원형질체(Protoplast)를 재료로 사용하고 있다.

(나) Agrobacterium 이용 방법

Agrobacterium은 토양중에 있는 Gram(-) 박테리아로써 식물의 상처부위에 침입하여 Corwn gall이라는 종양이나 Hairy rout를 형성하며 식물에 대해 광범위한 기주범위를 가지고 있다. 특이한 점은 이 박테리아가 가지고 있는 Ti plasmid나 Riplasmid에 특별한 DNA부분(T-DNA)이 식물체에 감염과 동시에 자연적으로 식물체의 genome속으로 들어가서 발현되다. 이 T-DNA는 Agrobacterium이 자신의 영양원으로 이용하는 아미노산 유도체인 Opine의 분비와 생산에 관여하는 효소를 Coding한다. Agrobacterium이 식물유전공학에서 중요하게 여겨지는 이유는 식물세포내로 유전자단편을 자연스럽게 집어넣을 수 있는 능력 때문이다. 과거 십수년간에 걸쳐 분자생물학자들이 식물에 외래유전자를 도입하기 위해 이 Agrobacterium의 T-DNA를 이용하기 위한 연구를 해 왔다. 식물에 유전자를 도입하는데 이용하기 위해서는 박테리아 자체와 기주식물체 양쪽의 조건을 최적화 해야 하는데 첫째, 식물체에 감염되는 적절한 Agrobacterium strain의 선정과 둘째, 식물체내에서 발현될 수 있도록 Ti-plasmid 나 Ri-plasmid를 개량하는 것 셋째, T-DNA가 발견될 수 있도록 전이 빈도를 높이는 것 그리고 유전자가 도입된 식물세포를 배양하여 식물체로 재생시킨후 선발하는 것이다. 가장 널리 쓰이는 도입과정은

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